Ụdị dị iche iche nke eriri akwara ọkpụkpụ mmadụ karịrị agbụ ígwè myosin

Daalụ maka ịga nature.com. Ụdị ihe nchọgharị ị na-eji nwere nkwado CSS pere mpe. Maka ahụmịhe kachasị mma, anyị na-akwado iji ụdị ihe nchọgharị kachasị ọhụrụ (ma ọ bụ gbanyụọ ọnọdụ ndakọrịta na Internet Explorer). Na mgbakwunye, iji hụ na nkwado na-aga n'ihu, saịtị a agaghị enwe ụdị na JavaScript.
Akwara ọkpụkpụ bụ anụ ahụ dị iche iche nke mejupụtara myofibrils, nke a na-ekewakarị n'ime mmadụ n'ụdị atọ: otu "nwayọọ" (ụdị 1) na abụọ "ngwa ngwa" (ụdị 2A na 2X). Agbanyeghị, ọdịiche dị n'etiti na n'ime ụdị myofibril ọdịnala ka dị mma. Anyị jiri ụzọ transcriptomic na proteomic mee ihe na 1050 na 1038 myofibrils nke mmadụ site na vastus lateralis, n'otu n'otu. Ọmụmụ ihe proteomic gụnyere ụmụ nwoke, ọmụmụ ihe transcriptomic ahụ gụnyere ụmụ nwoke 10 na ụmụ nwanyị 2. Na mgbakwunye na isoforms nke myosin dị arọ, anyị chọpụtara protein metabolic, protein ribosomal, na protein njikọ cellular dị ka isi iyi nke mgbanwe intermyofibril dị iche iche. Ọzọkwa, n'agbanyeghị njirimara nke ụyọkọ eriri dị nwayọ na ngwa ngwa, data anyị na-atụ aro na eriri ụdị 2X enweghị ike ịmata ọdịiche dị na eriri ndị ọzọ na-agba ọsọ ngwa ngwa. Ọzọkwa, nhazi nke dabere na yinye arọ nke myosin ezughi oke iji kọwaa ụdị myofiber dị na nemaline myopathies. N'ozuzu, data anyị na-egosi ụdị myofiber dị iche iche, yana isi mmalite nke mgbanwe gafere isoforms nke yinye arọ nke myosin.
Ọdịiche dị n'etiti sel bụ ihe dị n'ime sistemụ ndụ niile, na-enye mkpụrụ ndụ ohere pụrụ iche iji gboo mkpa dị iche iche nke anụ ahụ na mkpụrụ ndụ.1 Echiche ọdịnala nke ụdị eriri akwara skeletal bụ na neurons moto na-akọwa ụdị eriri dị n'ime otu moto, na ụdị eriri ahụ (dịka ọmụmaatụ, ụdị nke 1, ụdị nke 2A, na ụdị nke 2X n'ime mmadụ) na-ekpebi site na njirimara nke isoforms nke myosin heavy yinye (MYH).2 Nke a dabere na mbụ na enweghị ike pH ATPase ha, 3,4 na mgbe e mesịrị na ngosipụta molekul ha nke MYH.5 Agbanyeghị, site na njirimara na nnabata nke eriri "agwakọta" ndị na-egosipụta ọtụtụ MYHs n'ọkwa dị iche iche, a na-elekarị eriri akwara skeletal anya dị ka continuum kama dị ka ụdị eriri dị iche iche.6 N'agbanyeghị nke a, ubi ahụ ka na-adabere nke ukwuu na MYH dị ka ihe nhazi mbụ maka nhazi myofiber, echiche nwere ike imetụta site na mmachi na nnukwu ihe mgbochi nke ọmụmụ oke mbụ nke profaịlụ ngosipụta MYH na ụdị eriri dị iche na nke dị n'ime mmadụ.2 Ọnọdụ ahụ na-esikwu ike site n'eziokwu ahụ bụ na akwara ọkpụkpụ mmadụ dị iche iche na-egosipụta ụdị eriri dị iche iche.7 Vastus lateralis bụ akwara agwakọtara agwakọta nke nwere profaịlụ ngosipụta MYH dị n'etiti (ya mere na-anọchite anya ya). 7 Ọzọkwa, ịdị mfe nke ịnwale ya na-eme ka ọ bụrụ akwara kachasị mma n'ime mmadụ.
Ya mere, nnyocha na-enweghị mmasị nke ụdị eriri akwara ọkpụkpụ site na iji ngwaọrụ "omics" dị ike dị oke mkpa mana ọ na-esirikwa ike, n'otu akụkụ n'ihi ọdịdị nke eriri akwara ọkpụkpụ. Agbanyeghị, teknụzụ transcriptomics8,9 na proteomics10 agbanweela mgbanwe na mmetụta uche n'afọ ndị na-adịbeghị anya n'ihi ọganihu teknụzụ dị iche iche, na-enye ohere inyocha akwara ọkpụkpụ na mkpebi otu eriri. N'ihi ya, enwere ọganihu dị ukwuu n'ịkọwapụta ụdị eriri otu na nzaghachi ha na mkpali atrophic na ịka nká11,12,13,14,15,16,17,18. Ihe dị mkpa bụ na ọganihu teknụzụ ndị a nwere ngwa ahụike, na-enye ohere maka nkọwa zuru ezu na nke ziri ezi nke dysregulation metụtara ọrịa. Dịka ọmụmaatụ, pathophysiology nke nemaline myopathy, otu n'ime ọrịa akwara kachasị eketa (MIM 605355 na MIM 161800), dị mgbagwoju anya ma na-agbagwoju anya.19,20 Ya mere, njirimara ka mma nke dysregulation nke eriri akwara ọkpụkpụ nwere ike ibute ọganihu dị ukwuu na nghọta anyị banyere ọrịa a.
Anyị mepụtara ụzọ maka nyocha transcriptomic na proteomic nke otu eriri akwara ọkpụkpụ nke e kewapụrụ site na ihe nlele biopsy mmadụ ma tinye ha na ọtụtụ puku eriri, nke na-enye anyị ohere inyocha ọdịiche dị n'etiti eriri akwara ọkpụkpụ mmadụ. N'ọrụ a, anyị gosipụtara ike nke transcriptomic na proteomic phenotyping nke eriri akwara ma chọpụta protein metabolic, ribosomal, na cell junctional dị ka isi iyi dị mkpa nke mgbanwe interfiber. Ọzọkwa, site na iji usoro proteomic a, anyị kọwara mkpa ahụike nke nematode myopathy na otu eriri akwara ọkpụkpụ, na-ekpughe mgbanwe nhazi gaa na eriri ndị na-abụghị oxidative na-adabereghị na ụdị eriri dabere na MYH.
Iji nyochaa ọdịiche dị n'etiti eriri akwara mmadụ, anyị mepụtara usoro ọrụ abụọ iji mee ka nyocha transcriptome na proteome nke otu eriri akwara (Foto 1A na Foto Mgbakwunye 1A). Anyị mepụtara ma hazie ọtụtụ usoro usoro, site na nchekwa ihe nlele na nchekwa nke RNA na iguzosi ike n'ezi ihe protein ruo na ime ka mmepụta dị mma maka ụzọ ọ bụla. Maka nyocha transcriptome, emere nke a site na itinye barcode molekul kpọmkwem na nzọụkwụ mbụ nke ntụgharị azụ, na-enye ohere ka ejiri eriri 96 chịkọta maka nhazi dị irè. Usoro miri emi (± nde ọgụgụ kwa eriri) ma e jiri ya tụnyere ụzọ otu mkpụrụ ndụ ọdịnala mekwuru ka data transcriptome dịkwuo mma. 21 Maka proteomics, anyị jiri obere chromatographic gradient (nkeji 21) jikọtara ya na nnweta data DIA-PASEF na spectrometer mass timsTOF iji melite omimi proteome ma na-ejigide mmepụta dị elu. 22,23 Iji nyochaa ọdịiche dị n'etiti eriri akwara ọkpụkpụ dị mma, anyị kọwara transcriptome nke eriri 1,050 nkeonwe sitere na ndị okenye 14 nwere ahụike na proteomes nke eriri 1,038 sitere na ndị okenye ise nwere ahụike (Tebụl Mgbakwunye 1). N'akwụkwọ a, a na-akpọ datasets ndị a transcriptomes na proteomes 1,000-fiber, n'otu n'otu. Ụzọ anyị si achọpụta ngụkọta nke transcriptomes 27,237 na protein 2,983 na nyocha transcriptomic na proteomic 1,000-fiber (Foto 1A, Datasets Mgbakwunye 1–2). Mgbe enyochachara datasets transcriptomic na proteomic maka > 1,000 achọpụtara mkpụrụ ndụ ihe nketa na uru 50% dị irè kwa eriri, e mere nyocha bioinformatics ndị sochirinụ maka eriri 925 na 974 na transcriptome na proteome, n'otu n'otu. Mgbe enyochachara ya, achọpụtara nkezi nke mkpụrụ ndụ ihe nketa 4257 ± 1557 na protein 2015 ± 234 (nkezi ± SD) kwa eriri, yana obere mgbanwe dị n'etiti mmadụ na ibe ya (Foto Mgbakwunye 1B–C, Data Setịpụ Mgbakwunye 3–4). Agbanyeghị, mgbanwe dị n'ime isiokwu pụtara ìhè karịa n'etiti ndị sonyere, ikekwe n'ihi ọdịiche dị na mmepụta RNA/protein n'etiti eriri nke ogologo dị iche iche na mpaghara obe. Maka ọtụtụ protein (>2000), ọnụọgụ nke mgbanwe dị n'okpuru 20% (Foto Mgbakwunye 1D). Ụzọ abụọ a nyere ohere ijide ọtụtụ transcripts na protein nwere akara ngosi dị elu dị mkpa maka mkpụkọ akwara (dịka ọmụmaatụ, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Foto Mgbakwunye 1E–F). Ọtụtụ n'ime njirimara ndị a chọpụtara bụ ihe a na-ahụkarị n'etiti data transcriptomic na proteomic (Foto mgbakwunye 1G), na nkezi ike UMI/LFQ nke atụmatụ ndị a jikọtara nke ọma (r = 0.52) (Foto mgbakwunye 1H).
Usoro ọrụ nke transcriptomics na proteomics (eji BioRender.com mepụta). Usoro BD Dynamic range curves maka MYH7, MYH2, na MYH1, yana oke agbakọ maka ọrụ ụdị eriri. E, F Nkesa nke ngosipụta MYH n'ofe eriri na datasets transcriptomics na proteomics. G, H Atụmatụ Nhazi na Ntụle Ọdịiche Dị Iche Iche (UMAP) maka transcriptomics na proteomics agba site na ụdị eriri dabere na MYH. I, J Atụmatụ atụmatụ na-egosi ngosipụta MYH7, MYH2, na MYH1 na datasets transcriptomics na proteomics.
Anyị malitere ibido kenye ụdị eriri dabere na MYH na eriri ọ bụla site na iji usoro kachasị mma nke na-erite uru site na oke mmetụta na oke ike nke ngosipụta MYH na data omics. Ọmụmụ ihe ndị gara aga ejirila oke aka ike kpọọ eriri dị ka ụdị 1 dị ọcha, ụdị 2A, ụdị 2X, ma ọ bụ agwakọtara dabere na pasentị akọwapụtara nke ngosipụta nke MYHs11,14,24 dị iche iche. Anyị jiri ụzọ dị iche nke e si depụta ngosipụta nke eriri ọ bụla site na MYHs anyị jiri dee eriri ndị ahụ: MYH7, MYH2, na MYH1, nke kwekọrọ na ụdị 1, ụdị 2A, na ụdị 2X eriri, n'otu n'otu. Anyị gbakọọkwara ebe mgbanwe dị ala nke usoro ọ bụla si na ya pụta ma jiri ya dị ka oke iji kenye eriri dị ka ihe dị mma (n'elu oke) ma ọ bụ ihe na-adịghị mma (n'okpuru oke) maka MYH ọ bụla (Foto 1B-D). Data ndị a na-egosi na MYH7 (Foto 1B) na MYH2 (Foto 1C) nwere profaịlụ ngosipụta gbanye/gbanyụọ nke ọma na ọkwa RNA ma e jiri ya tụnyere ọkwa protein. N'ezie, n'ọkwa protein, obere eriri anaghị egosipụta MYH7, ọ dịghịkwa eriri nwere ngosipụta MYH2 100%. Anyị jiri oke ngosipụta ekpebie iji kenye ụdị eriri dabere na MYH na eriri niile dị na dataset ọ bụla. Dịka ọmụmaatụ, e kenyere eriri MYH7+/MYH2-/MYH1- na ụdị 1, ebe e kenyere eriri MYH7-/MYH2+/MYH1+ na ụdị 2A/2X agwakọtara (lee Tebụl Mgbakwunye 2 maka nkọwa zuru ezu). Mgbe anyị jikọtara eriri niile, anyị hụrụ nkesa yiri nke ụdị eriri dabere na MYH na ọkwa RNA (Foto 1E) na protein (Foto 1F), ebe nhazi nke ụdị eriri dabere na MYH dịgasị iche iche n'etiti ndị mmadụ n'otu n'otu, dịka a tụrụ anya ya (Foto Mgbakwunye 2A). E kewara ọtụtụ eriri dị ka ụdị 1 dị ọcha (34-35%) ma ọ bụ ụdị 2A (36-38%), ọ bụ ezie na achọpụtakwara ọnụọgụ dị ukwuu nke eriri 2A/2X agwakọtara (16-19%). Ihe dị iche bụ na a pụrụ ịchọpụta eriri ụdị 2X dị ọcha naanị na ọkwa RNA, mana ọ bụghị na ọkwa protein, nke na-egosi na a na-achịkwa ngosipụta MYH ngwa ngwa ma ọ dịkarịa ala n'ụzọ ụfọdụ mgbe edechara ya.
Anyị kwadoro usoro MYH fiber typing nke dabeere na proteomics site na iji ntụpọ antibody-based antibody, ụzọ abụọ ahụ kwekọrịtara 100% n'ịchọpụta eriri dị ọcha nke ụdị 1 na ụdị 2A (lee Foto Mgbakwunye 2B). Agbanyeghị, usoro dabere na proteomics dị nro karị, dịkwa irè karị n'ịchọpụta eriri agwakọtara, na ịtụle oke nke mkpụrụ ndụ ihe nketa MYH ọ bụla na eriri ọ bụla. Data ndị a na-egosi irè nke iji usoro dabere na omics nke dabere na ebumnuche na oke mmetụta iji mara ụdị eriri akwara ọkpụkpụ.
Anyị jiri ozi ejikọtara nke transcriptomics na proteomics nyere kewaa myofibers nke ọma dabere na transcriptome ma ọ bụ proteome ha zuru oke. Site na iji usoro nha anya na projection (UMAP) iji belata nha ahụ gaa na ihe isii bụ isi (Foto mgbakwunye 3A–B), anyị nwere ike ịhụ mgbanwe myofiber na transcriptome (Foto 1G) na proteome (Foto 1H). N'ụzọ dị mkpa, ndị sonyere ejikọtaghị myofibers (Foto mgbakwunye 3C–D) ma ọ bụ ụbọchị nnwale (Foto mgbakwunye 3E) na datasets transcriptomics ma ọ bụ proteomics, na-atụ aro na mgbanwe dị n'ime isiokwu na eriri akwara ọkpụkpụ dị elu karịa mgbanwe dị n'etiti isiokwu. Na atụmatụ UMAP, otu abụọ dị iche iche na-anọchite anya myofibers "ngwa ngwa" na "ngwa ngwa" pụtara (Foto 1G–H). E jikọtara eriri myofiber MYH7+ (nwayọọ) n'ogidi dị mma nke UMAP1, ebe e jikọtara eriri myofiber MYH2+ na MYH1+ (nwayọọ) n'ogidi adịghị mma nke UMAP1 (Foto 1I–J). Agbanyeghị, e nweghi ọdịiche dị n'etiti ụdị eriri na-agba ọsọ ọsọ (ya bụ, ụdị 2A, ụdị 2X, ma ọ bụ agwakọtara 2A/2X) dabere na ngosipụta MYH, na-egosi na ngosipụta MYH1 (Foto 1I–J) ma ọ bụ akara myofiber 2X ndị ọzọ dịka ACTN3 ma ọ bụ MYLK2 (Foto Mgbakwunye 4A–B) anaghị eme ọdịiche dị n'etiti ụdị myofiber dị iche iche mgbe a na-atụle transcriptome ma ọ bụ proteome dum. Ọzọkwa, ma e jiri ya tụnyere MYH2 na MYH7, obere transcript ma ọ bụ protein nwere njikọ dị mma na MYH1 (Foto Mgbakwunye 4C–H), na-egosi na oke MYH1 anaghị egosipụta transcriptome/proteome myofiber nke ọma. E mechara nkwubi okwu ndị yiri nke ahụ mgbe a na-enyocha ngosipụta dị iche iche nke isoforms MYH atọ ahụ na ọkwa UMAP (Foto mgbakwunye 4I–J). Ya mere, ebe enwere ike ịchọpụta eriri 2X na ọkwa transcript dabere na naanị nha MYH, a naghị amata eriri MYH1+ site na eriri ngwa ngwa ndị ọzọ mgbe a na-atụle transcriptome ma ọ bụ proteome dum.
Dịka nchọpụta mbụ nke ụdị eriri dị nwayọ karịa MYH, anyị tụlere protein anọ e guzobere na ụdị eriri dị nwayọ: TPM3, TNNT1, MYL3, na ATP2A22. Ụdị eriri dị nwayọ gosiri njikọ Pearson na MYH7 dị elu, ọ bụ ezie na ọ bụghị zuru oke, na transcriptomics (Foto mgbakwunye 5A) na proteomics (Foto mgbakwunye 5B). Ihe dị ka 25% na 33% nke eriri dị nwayọ abụghị nkewa dị ka eriri dị nro site na ụdị mkpụrụ ndụ ihe nketa/protein niile na transcriptomics (Foto mgbakwunye 5C) na proteomics (Foto mgbakwunye 5D), n'otu n'otu. Ya mere, nhazi eriri dị nwayọ dabere na ụdị mkpụrụ ndụ ihe nketa/protein dị iche iche na-ewebata mgbagwoju anya ọzọ, ọbụlagodi maka protein a maara dị ka ụdị eriri. Nke a na-egosi na nhazi eriri dabere na isoforms nke otu mkpụrụ ndụ ihe nketa/protein ezinụlọ nwere ike ọ gaghị egosipụta nke ọma ọdịiche dị n'etiti eriri akwara ọkpụkpụ.
Iji chọpụtakwuo mgbanwe dị iche iche nke eriri akwara mmadụ na nha nke ụdị omics dum, anyị mere mbelata nha nke data site na iji nyocha akụkụ bụ isi (PCA) (Foto 2A). Dị ka atụmatụ UMAP, ọ dịghị onye sonyere ma ọ bụ ụbọchị nnwale emetụtara nchịkọta eriri na ọkwa PCA (Foto ndị ọzọ 6A–C). Na dataset abụọ ahụ, PC2 kọwara ụdị eriri dabere na MYH, nke gosipụtara otu eriri nke eriri 1 dị nwayọ nwayọ na otu nke abụọ nwere ụdị 2A dị ngwa ngwa, ụdị 2X, na eriri 2A/2X agwakọtara (Foto 2A). Na dataset abụọ ahụ, obere ọnụọgụ nke eriri 1/2A agwakọtara jikọtara otu abụọ a. Dịka a tụrụ anya ya, nyocha oke nnọchiteanya nke ndị ọkwọ ụgbọala PC bụ isi kwadoro na PC2 na-agba ọsọ site na nkwekọrịta na mbinye aka metabolic (Foto 2B na Foto ndị ọzọ 6D–E, Data Setịpụ Mgbakwunye 5–6). N'ozuzu, achọpụtara na ụdị eriri nke dabere na MYH zuru oke iji kọwaa mgbanwe na-aga n'ihu na PC2, ewezuga eriri 2X nke kesara n'ofe transcriptome n'ime otu ngwa ngwa.
A. Nchịkọta ihe dị mkpa (PCA) nke nhazi data transcriptome na proteome agba dịka ụdị eriri si dị dabere na MYH. B. Nyocha mmụba nke ndị ọkwọ ụgbọala transcript na protein na PC2 na PC1. Ejiri ngwugwu clusterProfiler na Benjamini-Hochberg gbanwee p-values ​​mee nyocha ọnụọgụgụ. C, D. Atụmatụ PCA agba dịka usoro mkpụrụ ndụ ihe nketa intercellular adhesion (GO) si dị na okwu transcriptome na costamere GO na proteome. Akụ na-anọchite anya ndị ọkwọ ụgbọala transcript na protein na ntụziaka ha. E, F. Nhazi atụmatụ na projection (UMAP) nke atụmatụ dị mkpa maka ahụike na-egosi gradients ngosipụta na-adabereghị na ụdị eriri nwayọ/ngwa ngwa. G, H. Mmekọrịta dị n'etiti ndị ọkwọ ụgbọala PC2 na PC1 na transcriptomes na proteomes.
N'ụzọ a na-atụghị anya ya, ụdị myofiber nke dabeere na MYH kọwara naanị ọkwa nke abụọ kachasị elu nke mgbanwe (PC2), na-egosi na ihe ndị ọzọ dị ndụ na-ejikọtaghị na ụdị myofiber nke dabere na MYH (PC1) na-arụ ọrụ dị mkpa n'ịchịkwa ọdịiche dị n'etiti eriri akwara ọkpụkpụ. Nnyocha nke oke nnọchi anya nke ndị ọkwọ ụgbọala kachasị elu na PC1 gosiri na mgbanwe dị na PC1 bụ isi ihe dabere na njikọta mkpụrụ ndụ na ọdịnaya ribosome na transcriptome, yana costameres na ribosomal protein na proteome (Foto 2B na Foto Mgbakwunye 6D–E, Setịpụ Data Mgbakwunye 7). Na akwara ọkpụkpụ, costameres na-ejikọ diski Z na sarcolemma ma na-etinye aka na nnyefe ike na mgbama. 25 Atụmatụ PCA e depụtara site na iji njikọta mkpụrụ ndụ sel (transcriptome, Foto 2C) na costamere (proteome, Foto 2D) kpughere mgbanwe aka ekpe siri ike na PC1, na-egosi na atụmatụ ndị a bara ụba na ụfọdụ eriri.
Nnyocha zuru ezu nke nchịkọta myofiber na ọkwa UMAP gosiri na ọtụtụ njirimara gosipụtara ụdị ngosipụta MYH nke dabere na ụdị myofiber kama nke myofiber subcluster-specific. A hụrụ usoro a maka ọtụtụ mkpụrụ ndụ ihe nketa metụtara ọnọdụ ọrịa (Foto 2E), dị ka CHCHD10 (ọrịa neuromuscular), SLIT3 (atrophy akwara), CTDNEP1 (ọrịa akwara). A hụkwara usoro a n'ofe proteome, gụnyere protein ndị metụtara nsogbu akwara ozi (UGDH), insulin signaling (PHIP), na transcription (HIST1H2AB) (Foto 2F). N'ozuzu, data ndị a na-egosi usoro na-aga n'ihu na ụdị eriri dị iche iche na-aga n'ihu/ngwa ngwa n'ofe myofiber dị iche iche.
N'ụzọ na-adọrọ mmasị, mkpụrụ ndụ ihe nketa ndị ọkwọ ụgbọala na PC2 gosiri ezigbo njikọ transcriptome-proteome (r = 0.663) (Foto 2G), na-egosi na ụdị eriri na-agba ọsọ nwayọ na nke na-agba ọsọ, ọkachasị ihe ndị metụtara nkwekọrịta na nke metabolic nke eriri akwara ọkpụkpụ, ka a na-achịkwa site na ntụgharị. Agbanyeghị, mkpụrụ ndụ ihe nketa ndị ọkwọ ụgbọala na PC1 egosighi njikọ transcriptome-proteome ọ bụla (r = -0.027) (Foto 2H), na-egosi na mgbanwe ndị na-adịghị na ụdị eriri na-agba ọsọ/na-agba ọsọ na-achịkwa nke ukwuu mgbe ntụgharị. N'ihi na a kọwara mgbanwe dị na PC1 site na okwu mkpụrụ ndụ ihe nketa ribosomal, ebe ọ bụ na ribosomes na-arụ ọrụ dị mkpa na nke pụrụ iche na sel site na isonye na na-emetụta nsụgharị protein, 31 anyị na-amalite ọzọ inyocha ọdịiche ribosomal a na-atụghị anya ya.
Anyị buru ụzọ tee agba nke proteomics dịka ọnụọgụ protein dị na okwu GOCC bụ "cytoplasmic ribosome" (Foto 3A). Ọ bụ ezie na okwu a bara ụba n'akụkụ dị mma nke PC1, nke butere obere gradient, protein ribosomal na-akwalite nkewa n'akụkụ abụọ nke PC1 (Foto 3A). Protein ribosomal ndị bara ụba n'akụkụ ọjọọ nke PC1 gụnyere RPL18, RPS18, na RPS13 (Foto 3B), ebe RPL31, RPL35, na RPL38 (Foto 3C) bụ isi ihe na-akpata PC1. N'ụzọ na-adọrọ mmasị, a na-egosipụta RPL38 na RPS13 nke ọma na akwara ọkpụkpụ ma e jiri ya tụnyere anụ ahụ ndị ọzọ (Foto 7A). Ahụghị akara ribosomal ndị a pụrụ iche na PC1 na transcriptome (Foto 7B), na-egosi iwu mgbe transcription gasịrị.
A. Nnyocha akụkụ bụ isi (PCA) agbaala agba dịka usoro cytoplasmic ribosomal gene ontology (GO) si dị n'ofe proteome. Akụ na-egosi ntụziaka nke mgbanwe protein na-eme na atụmatụ PCA. Ogologo ahịrị kwekọrọ na akara akụkụ bụ isi maka protein enyere. B, C. Atụmatụ atụmatụ PCA maka RPS13 na RPL38. D. Nyocha nhazi ọkwa nke protein ribosomal cytoplasmic na-enweghị nlekọta. E. Ụdị nhazi nke ribosome 80S (PDB: 4V6X) na-egosipụta protein ribosomal nwere ọtụtụ dị iche iche na eriri akwara ọkpụkpụ. F. Protein ribosomal nwere stoichiometry dị iche iche dị nso na ọwa mRNA.
E bu ụzọ tụọ aro echiche nke ụdị ribosomal dị iche iche na ọpụrụiche, ebe ọnụnọ nke ụdị ribosomal dị iche iche (ribosomal heterogeneity) nwere ike imetụta ntụgharị protein ozugbo na anụ ahụ dị iche iche32 na sel33 site na ntụgharị nhọrọ nke mRNA transcript pools34 kpọmkwem (ọpụrụiche ribosome). Iji chọpụta ọnụọgụgụ nke protein ribosomal nke egosipụtara na eriri akwara ọkpụkpụ, anyị mere nyocha nhazi ọkwa nke a na-anaghị elekọta nke protein ribosomal na proteome (Foto 3D, Setịpụ Data Mgbakwunye 8). Dịka a tụrụ anya ya, protein ribosomal ejikọtaghị site na ụdị eriri dabere na MYH. Agbanyeghị, anyị chọpụtara ụyọkọ atọ dị iche iche nke protein ribosomal; ụyọkọ mbụ (ribosomal_cluster_1) jikọtara ya na RPL38 ma si otú a nwee mmụba ngosipụta na eriri nwere profaịlụ PC1 dị mma. A na-ejikọta ụyọkọ nke abụọ (ribosomal_cluster_2) na RPS13 ma na-ebuli ya elu na eriri nwere profaịlụ PC1 na-adịghị mma. Njikọ nke atọ (ribosomal_cluster_3) anaghị egosi ngosipụta dị iche iche na eriri akwara ọkpụkpụ, a pụkwara iwere ya dị ka protein ribosomal nke akwara ọkpụkpụ "isi". Mkpụrụ osisi ribosomal abụọ 1 na 2 nwere protein ribosomal nke egosiri na mbụ na-achịkwa ntụgharị ọzọ (dịka ọmụmaatụ, RPL10A, RPL38, RPS19, na RPS25) ma na-emetụta mmepe ọrụ (dịka ọmụmaatụ, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Dịka nsonaazụ PCA si dị, nnọchite anya dị iche iche nke protein ribosomal ndị a n'ofe eriri gosikwara na ha na-aga n'ihu (Foto mgbakwunye 7C).
Iji lee anya n'ebe protein ribosomal dị iche iche dị n'ime ribosome ahụ dị, anyị jiri ihe nlereanya nhazi nke ribosome mmadụ 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (Foto 3E). Mgbe anyị kewapụrụ protein ribosomal nke dị na ụyọkọ ribosomal dị iche iche, ọnọdụ ha adịghị n'otu, na-egosi na ụzọ anyị si eme ka ọ baa uru maka mpaghara/akụkụ ụfọdụ nke ribosome. Otú ọ dị, ọ dị mma ịmara na oke nke nnukwu protein subunit na ụyọkọ 2 dị ala karịa na ụyọkọ 1 na 3 (Foto Mgbakwunye 7D). Anyị hụrụ na protein nwere stoichiometry agbanwere agbanwe na eriri akwara ọkpụkpụ dị n'elu ribosome (Foto 3E), kwekọrọ na ikike ha nwere iji ihe dị n'ime ribosome (IRES) mee ihe na ọnụọgụ mRNA dị iche iche, si otú a na-ahazi ntụgharị nhọrọ. 40, 41 Ọzọkwa, ọtụtụ protein nwere stoichiometry agbanwere agbanwe na eriri akwara ọkpụkpụ dị nso na mpaghara ọrụ dịka ọwara ọpụpụ mRNA (Foto 3F), nke na-achịkwa ogologo ntụgharị na njide nke peptides kpọmkwem. 42 Na nchịkọta, data anyị na-egosi na stoichiometry nke protein ribosomal muscle skeletal na-egosipụta ọdịiche dị iche iche, na-ebute ọdịiche dị n'etiti eriri akwara skeletal.
Anyị na-esote ịmalite ịchọpụta mbinye aka eriri ngwa ngwa na nwayọ ma chọpụta usoro nke nhazi akwụkwọ ha. Site n'ịtụnyere ụyọkọ eriri ngwa ngwa na nwayọ nke UMAP kọwara na dataset abụọ ahụ (Foto 1G–H na 4A–B), nyocha transcriptomic na proteomic chọpụtara atụmatụ dị iche iche nke 1366 na 804, n'otu n'otu (Foto 4A–B, Datasets Mgbakwunye 9–12). Anyị hụrụ ọdịiche a tụrụ anya ya na mbinye aka metụtara sarcomeres (dịka ọmụmaatụ, tropomyosin na troponin), njikọ mkpali-mkpọchi (SERCA isoforms), na metabolism ike (dịka ọmụmaatụ, ALDOA na CKB). Ọzọkwa, e gosipụtara transcripts na protein ndị na-achịkwa ubiquitination protein dị iche iche na eriri ngwa ngwa na nwayọ (dịka ọmụmaatụ, USP54, SH3RF2, USP28, na USP48) (Foto 4A–B). Ọzọkwa, mkpụrụ ndụ ihe nketa protein nje RP11-451G4.2 (DWORF), nke egosiri na mbụ na-egosipụta n'ụzọ dị iche iche n'ụdị eriri anụ atụrụ43 ma na-eme ka ọrụ SERCA dị na akwara obi44, ka amụbawanye nke ukwuu na eriri akwara ọkpụkpụ dị nwayọ (Foto 4A). N'otu aka ahụ, n'ọkwa eriri nke ọ bụla, a hụrụ nnukwu ọdịiche na mbinye aka ama ama dịka metabolite-related lactate dehydrogenase isoforms (LDHA na LDHB, Foto 4C na Foto Mgbakwunye 8A)45,46 yana mbinye aka ụdị eriri a na-amaghị na mbụ (dịka IRX3, USP54, USP28, na DPYSL3) (Foto 4C). E nwere nnukwu njikọta nke njirimara egosipụtara dị iche iche n'etiti datasets transcriptomic na proteomic (Foto Mgbakwunye 8B), yana njikọ mgbanwe mpịachi nke bụ isi site na ngosipụta dị iche iche nke atụmatụ sarcomere (Foto Mgbakwunye 8C). Ihe pụrụ iche bụ na ụfọdụ mbinye aka (dịka USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) gosiri iwu siri ike mgbe e dechara akwụkwọ naanị na ọkwa proteomic ma nwee profaịlụ ngosipụta nke ụdị eriri dị nwayọ/ngwa ngwa (Foto mgbakwunye 8C).
Atụmatụ ugwu mgbawa A na B na-atụnyere mkpokọta dị nwayọ na ngwa ngwa nke ejiri atụmatụ manifold approximation and projection (UMAP) dị na eserese 1G–H chọpụta. Akara agba na-anọchite anya transcript ma ọ bụ protein ndị dị iche na FDR < 0.05, ntụpọ gbara ọchịchịrị na-anọchite anya transcript ma ọ bụ protein ndị dị iche na mgbanwe ndekọ > 1. E mere nyocha ọnụọgụgụ ụzọ abụọ site na iji ule DESeq2 Wald na ụkpụrụ p nke Benjamini-Hochberg gbanwere (transcriptomics) ma ọ bụ usoro ihe nlereanya Limma linear yana nyocha Bayesian empirical wee soro mgbanwe Benjamini-Hochberg maka ọtụtụ ntụnyere (proteomics). C Atụmatụ akara nke mkpụrụ ndụ ihe nketa ma ọ bụ protein ndị a họọrọ n'etiti eriri dị nwayọ na ngwa ngwa. D Nyocha mmụba nke transcript na protein ndị a gosipụtara n'ụzọ dị iche iche. A na-eme ka ụkpụrụ ndị na-ekpuchi ibe ha dịkwuo mma na dataset abụọ ahụ, a na-eme ka ụkpụrụ transcriptome dịkwuo mma naanị na transcriptome, a na-emekwa ka ụkpụrụ proteome dịkwuo mma naanị na proteome. E mere nyocha ọnụọgụgụ site na iji ngwugwu clusterProfiler na ụkpụrụ p nke Benjamini-Hochberg agbanwere agbanwe. E. Ihe ndị metụtara ụdị eriri nke SCENIC chọpụtara dabere na akara njirimara nke onye na-achịkwa SCENIC sitere na ya na ngosipụta mRNA dị iche n'etiti ụdị eriri. F. Nkọwapụta nke ihe ndị metụtara ntụgharị ahọpụtara nke e gosipụtara n'etiti eriri dị nwayọ na nke dị ngwa ngwa.
Anyị mechara mee nyocha nke oke ihe gbasara mkpụrụ ndụ ihe nketa na protein ndị a na-egosipụta n'ụzọ dị iche iche (Foto 4D, Setịpụ Data Mgbakwunye 13). Mmezi ụzọ maka atụmatụ ndị dị iche n'etiti dataset abụọ ahụ kpughere ọdịiche a tụrụ anya ya, dịka fatty acid β-oxidation na usoro metabolism ketone (eriri nwayọ), myofilament/muscle contract (eriri ngwa ngwa na nwayọ, n'otu n'otu), na carbohydrate catabolic process (eriri ngwa ngwa). Ọrụ phosphatase protein Serine/threonine dịkwa elu na eriri ngwa ngwa, nke atụmatụ dịka subunits phosphatase na catalytic na-akwalite (PPP3CB, PPP1R3D, na PPP1R3A), nke a maara na ha na-achịkwa metabolism glycogen (47) (Foto Mgbakwunye 8D–E). Ụzọ ndị ọzọ e ji eriri ngwa ngwa mee ka ha baa ụba gụnyere nhazi (P-) ahụ (YTHDF3, TRIM21, LSM2) na proteome (Mgbakwunye Fig. 8F), nke nwere ike itinye aka na nhazi post-transcriptional (48), na ọrụ ihe ntụgharị (SREBF1, RXRG, RORA) na transcriptome (Mgbakwunye Fig. 8G). E tinyere eriri dị nwayọ n'ọrụ oxidoreductase (BDH1, DCXR, TXN2) (Mgbakwunye Fig. 8H), njikọ amide (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Mgbakwunye Fig. 8I), extracellular matrix (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Mgbakwunye Fig. 8J), na ọrụ receptor-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (Mgbakwunye Fig. 8K).
Iji nweta nghọta ọzọ gbasara iwu ntụgharị okwu nke dị n'okpuru njirimara ụdị eriri akwara nwayọ/ngwa ngwa, anyị mere nyocha mmụba nke ihe ntụgharị okwu site na iji SCENIC49 (Nchịkọta Data 14). Ọtụtụ ihe ntụgharị okwu bara ụba nke ukwuu n'etiti eriri akwara ngwa ngwa na nwayọ (Nkeji 4E). Nke a gụnyere ihe ntụgharị okwu dịka MAFA, nke ejikọtara na mmepe eriri akwara ngwa ngwa,50 yana ọtụtụ ihe ntụgharị okwu na-ejikọghị na mmemme mkpụrụ ndụ ihe nketa nke ụdị eriri akwara. N'ime ndị a, PITX1, EGR1, na MYF6 bụ ihe ntụgharị okwu kachasị baa ọgaranya na eriri akwara ngwa ngwa (Nkeji 4E). N'ụzọ dị iche, ZSCAN30 na EPAS1 (nke a makwaara dị ka HIF2A) bụ ihe ntụgharị okwu kachasị baa ọgaranya na eriri akwara ngwa ngwa (Nkeji 4E). N'ikwekọ na nke a, e gosipụtara MAFA na ọkwa dị elu na mpaghara UMAP nke kwekọrọ na eriri akwara ngwa ngwa, ebe EPAS1 nwere ụkpụrụ ngosipụta dị iche (Nkeji 4F).
Na mgbakwunye na mkpụrụ ndụ ihe nketa a maara maka koodu protein, enwere ọtụtụ ụdị RNA na-abụghị koodu nke nwere ike itinye aka na nhazi nke mmepe mmadụ na ọrịa. 51, 52 Na datasets transcriptome, ọtụtụ RNA na-abụghị koodu na-egosipụta ụdị eriri (Foto 5A na Dataset Mgbakwunye 15), gụnyere LINC01405, nke dị oke mkpa maka eriri dị nwayọ ma a kọrọ na ọ na-ebelata na akwara site na ndị ọrịa nwere mitochondrial myopathy. 53 N'ụzọ dị iche, RP11-255P5.3, nke kwekọrọ na mkpụrụ ndụ ihe nketa lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, na-egosipụta ụdị eriri ngwa ngwa. Ma LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) na RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) na-egosipụta njirimara akwara ọkpụkpụ (Agbakwunye Figures 9A–B) ma ha enweghị mkpụrụ ndụ ihe nketa a maara n'ime agbataobi genomic ha nke 1 Mb, nke na-egosi na ha na-arụ ọrụ pụrụ iche n'ịchịkwa ụdị eriri kama ịchịkwa mkpụrụ ndụ ihe nketa ndị agbata obi. E jiri RNAscope kwado profaịlụ ngosipụta nke ụdị eriri dị nwayọ/ngwa ngwa (Foto 5B–C).
A. A na-achịkwa akwụkwọ ndekọ RNA na-abụghị koodu nke ọma na eriri akwara na-agba ọsọ nwayọ na nke na-agba ọsọ. B. Foto RNAscope ndị nnọchiteanya na-egosi ụdị eriri eriri na-agba ọsọ nwayọ na nke na-agba ọsọ nke LINC01405 na RP11-255P5.3, n'otu n'otu. Ogwe nha = 50 μm. C. Ngụkọta nke ngosipụta RNA nke na-abụghị koodu nke ụdị myofiber dịka RNAscope siri chọpụta (n = biopsies 3 sitere n'aka ndị nọọrọ onwe ha, na-atụnyere eriri akwara ngwa ngwa na nke dị nwayọ n'ime onye ọ bụla). E mere nyocha ọnụọgụgụ site na iji ule t-test nke nwa akwụkwọ nwere ọdụ abụọ. Atụmatụ igbe na-egosi etiti na quartile nke mbụ na nke atọ, yana ajị anụ na-atụ aka na uru kacha nta na nke kachasị. D. Usoro ọrụ njirimara protein microbial nke De novo (emepụtara na BioRender.com). E. A na-egosipụta protein nje LINC01405_ORF408:17441:17358 kpọmkwem na eriri akwara ọkpụkpụ dị nwayọ (n=5 biopsies sitere n'aka ndị sonyere nọọrọ onwe ha, na-atụnyere eriri akwara ngwa ngwa na nwayọ na onye ọ bụla sonyere). E mere nyocha ọnụọgụgụ site na iji usoro ihe nlereanya Limm linear jikọtara ya na ụzọ Bayesian empirical, wee soro usoro Benjamini-Hochberg maka ọtụtụ ntụnyere na mgbanwe uru p. Ihe osise igbe na-egosi quartiles etiti, nke mbụ na nke atọ, yana ajị anụ na-atụ aka na uru kachasị/kachasị.
N'oge na-adịbeghị anya, ọmụmụ ihe egosila na ọtụtụ akwụkwọ ndetu na-abụghị koodu na-akọwapụta protein nje ndị e dere ede, ụfọdụ n'ime ha na-achịkwa ọrụ akwara. 44, 55 Iji chọpụta protein nje ndị nwere ụdị eriri nwere ike ịpụta ìhè, anyị jiri faịlụ FASTA omenala nke nwere usoro nke akwụkwọ ndetu na-abụghị koodu (n = 305) dị na dataset 1000 fiber transcriptome (Foto 5D). Anyị chọpụtara protein nje 197 site na akwụkwọ ndetu 22 dị iche iche, 71 n'ime ha nwere nhazi dị iche iche n'etiti eriri akwara ọkpụkpụ dị nwayọ na ngwa ngwa (Foto Mgbakwunye 9C na Setịpụ Data Mgbakwunye 16). Maka LINC01405, achọpụtara ngwaahịa protein nje atọ, otu n'ime ha gosipụtara nkọwapụta eriri nwayọ na akwụkwọ ndetu ya (Foto 5E na Foto Mgbakwunye 9D). Ya mere, anyị chọpụtara LINC01405 dị ka mkpụrụ ndụ ihe nketa na-akọwapụta protein nje nke kpọmkwem maka eriri akwara ọkpụkpụ dị nwayọ.
Anyị mepụtara usoro ọrụ zuru oke maka njirimara proteomic buru ibu nke eriri akwara nke ọ bụla ma chọpụta ndị na-achịkwa ụdị eriri dị iche iche na ọnọdụ ahụike. Anyị jiri usoro ọrụ a mee ihe iji ghọta otu nemaline myopathies si emetụta ụdị eriri akwara skeletal. Nemaline myopathies bụ ọrịa akwara eketa nke na-akpata adịghị ike akwara, na ụmụaka metụtara, na-enwe ọtụtụ nsogbu gụnyere nsogbu iku ume, scoliosis, na obere mmegharị aka na ụkwụ. 19,20 Dịka ọ na-adịkarị, na nemaline myopathies, mgbanwe pathogenic na mkpụrụ ndụ ihe nketa dịka actin alpha 1 (ACTA1) na-ebute oke nke eriri myofiber dị nwayọ nwayọ, ọ bụ ezie na mmetụta a dị iche iche. Otu ihe a na-apụghị ịkọwapụta bụ troponin T1 nemaline myopathy (TNNT1), nke nwere ọtụtụ eriri ngwa ngwa. Ya mere, nghọta ka mma nke ụdị dị iche iche dị n'okpuru dysregulation eriri akwara skeletal a hụrụ na nemaline myopathies nwere ike inyere aka idozi mmekọrịta dị mgbagwoju anya dị n'etiti ọrịa ndị a na ụdị myofiber.
Ma e jiri ya tụnyere njikwa ahụike (n=3 kwa otu), myofibers e kewapụrụ site na ndị ọrịa nemaline myopathy nwere mgbanwe na mkpụrụ ndụ ihe nketa ACTA1 na TNNT1 gosiri akara myofiber atrophy ma ọ bụ dystrophy (Foto 6A, Tebụl Mgbakwunye 3). Nke a wetara nnukwu ihe ịma aka teknụzụ maka nyocha proteomic n'ihi obere ihe dị. N'agbanyeghị nke a, anyị nwere ike ịchọpụta protein 2485 na myofibers ọkpụkpụ 272. Mgbe a sachara maka protein dịkarịa ala 1000 a tụrụ atụ kwa eriri, e tinyere eriri 250 na nyocha bioinformatics sochirinụ. Mgbe a sachara, a tụrụ nkezi nke protein 1573 ± 359 kwa eriri (Foto Mgbakwunye 10A, Setịpụ Data Mgbakwunye 17–18). Nke pụtara ìhè bụ na n'agbanyeghị mbelata dị ukwuu na nha eriri, omimi proteome nke ihe nlele ndị ọrịa nemaline myopathy belatara obere. Ọzọkwa, iji faịlụ FASTA anyị (gụnyere akwụkwọ ndị na-abụghị koodu) hazie data ndị a nyere anyị ohere ịchọpụta protein nje ise dị na myofibers ọkpụkpụ site na ndị ọrịa nemaline myopathy (Nchịkọta Data 19). Oke ike nke proteome ahụ sara mbara nke ukwuu, protein zuru oke dị na otu njikwa ahụ jikọtara nke ọma na nsonaazụ nke nyocha proteome 1000-fiber gara aga (Nchịkọta Foto 10B–C).
A. Foto ndị a na-ahụ anya na-egosi atrophy eriri ma ọ bụ dystrophy na oke nke ụdị eriri dị iche iche dabere na MYH na ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathies (NM). Ogwe nha = 100 μm. Iji hụ na agba agba na ndị ọrịa ACTA1 na TNNT1 nwere ike ịpụta ọzọ, e tinyere ihe ndị a na-ahụ maka ndị ọrịa atọ n'ime ha ugboro abụọ ruo atọ (ngalaba anọ kwa ikpe) tupu ha ahọrọ onyonyo ndị a na-ahụ anya. B. Oke ụdị eriri na ndị sonyere dabere na MYH. C. Isi nyocha akụkụ (PCA) nke eriri akwara ọkpụkpụ na ndị ọrịa nwere nemaline myopathies na njikwa. D. Eriri akwara ọkpụkpụ sitere na ndị ọrịa nwere nemaline myopathies na njikwa atụpụtara na atụmatụ PCA nke e si na eriri 1000 a nyochachara na Foto 2. Dịka ọmụmaatụ, atụmatụ ugwu mgbawa na-atụnyere ọdịiche dị n'etiti ndị sonyere na ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathies na njikwa, na n'etiti ndị sonyere na ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathies. Okirikiri agba na-egosi protein ndị dị iche na π < 0.05, ntụpọ gbara ọchịchịrị na-egosi protein ndị dị iche na FDR < 0.05. E jiri usoro ihe nlereanya Limma linear na usoro Bayesian empirical mee nyocha ọnụọgụgụ, wee jiri usoro Benjamini-Hochberg mee mgbanwe uru p maka ọtụtụ ntụnyere. H. Nyocha mmụba nke protein ndị a na-egosipụta nke ọma n'ofe proteome dum na eriri ụdị 1 na 2A. E jiri ngwugwu clusterProfiler na Benjamini-Hochberg gbanwere ụkpụrụ p mee nyocha ọnụọgụgụ. I, J. Nchịkọta ihe mejupụtara isi (PCA) nke agbachara site na matrix extracellular na okwu mitochondrial gene ontology (GO).
Ebe ọ bụ na nemaline myopathies nwere ike imetụta oke nke ụdị myofiber na-egosipụta MYH na akwara ọkpụkpụ, anyị buru ụzọ leba anya n'ụdị myofiber na-egosipụta MYH na ndị ọrịa nwere nemaline myopathies na njikwa. Anyị chọpụtara ụdị myofiber site na iji usoro akọwapụtara na mbụ maka nnwale myofiber 1000 (Foto mgbakwunye 10D–E) ma ọzọ enweghị ike ịchọpụta myofibers 2X dị ọcha (Foto 6B). Anyị hụrụ mmetụta dị iche iche nke nemaline myopathies na ụdị myofiber, ebe ndị ọrịa abụọ nwere mgbanwe ACTA1 nwere mmụba nke ụdị myofibers 1, ebe ndị ọrịa abụọ nwere TNNT1 nemaline myopathy nwere mbelata nke ụdị myofibers 1 (Foto 6B). N'ezie, ngosipụta nke MYH2 na ngwa ngwa troponin isoforms (TNNC2, TNNI2, na TNNT3) belatara na ACTA1-nemaline myopathies, ebe ngosipụta MYH7 belatara na TNNT1-nemaline myopathies (Foto mgbakwunye 11A). Nke a kwekọrọ na akụkọ ndị gara aga nke mgbanwe ụdị myofiber dị iche iche na nemaline myopathies.19,20 Anyị kwadoro nsonaazụ ndị a site na immunohistochemistry ma chọpụta na ndị ọrịa nwere ACTA1-nemaline myopathy nwere ọtụtụ myofibers ụdị 1, ebe ndị ọrịa nwere TNNT1-nemaline myopathy nwere ụdị dị iche (Foto 6A).
N'ọkwa proteome otu eriri, eriri akwara ọkpụkpụ sitere na ndị ọrịa ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathy jikọtara ọnụ na ọtụtụ eriri njikwa, yana eriri nemaline myopathy TNNT1 bụ nke kacha emetụta (Foto 6C). Nke a pụtara ìhè karịsịa mgbe a na-eme atụmatụ nyocha akụkụ bụ isi (PCA) nke eriri pseudo-inflated maka onye ọrịa ọ bụla, yana ndị ọrịa nemaline myopathy TNNT1 2 na 3 na-apụta n'ebe kachasị anya site na ihe nlele njikwa (Foto Mgbakwunye 11B, Setịpụ Data Mgbakwunye 20). Iji ghọta nke ọma otu eriri sitere na ndị ọrịa myopathy si tụnyere eriri ahụike, anyị jiri ozi zuru ezu enwetara site na nyocha proteomic nke eriri 1,000 sitere na ndị sonyere okenye nwere ahụike. Anyị tụrụ anya eriri sitere na dataset myopathy (ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathy na njikwa) na plot PCA nke enwetara site na nyocha proteomic 1000-fiber (Foto 6D). Nkesa nke ụdị eriri MYH n'akụkụ PC2 na eriri njikwa yiri nkesa eriri e nwetara site na nyocha proteomic nke eriri 1000. Agbanyeghị, ọtụtụ eriri dị na ndị ọrịa nemaline myopathy gbanwere PC2, na-ejikọta ya na eriri ndị dị mma na-agbagharị agbagharị, n'agbanyeghị ụdị eriri MYH ha. Ya mere, ọ bụ ezie na ndị ọrịa nwere ACTA1 nemaline myopathy gosipụtara mgbanwe gaa na eriri ụdị 1 mgbe ejiri usoro dabere na MYH tụọ ha, ma ACTA1 nemaline myopathy na TNNT1 nemaline myopathy gbanwere proteome eriri akwara skeletal gaa na eriri ndị na-agbagharị agbagharị ngwa ngwa.
Anyị wee jiri otu onye ọrịa ọ bụla tụnyere ndị nwere ahụike ma chọpụta protein 256 na 552 nke nwere ọdịiche dị iche na myopathies nke ACTA1 na TNNT1 nemaline, n'otu n'otu (Foto 6E–G na Foto Mgbakwunye 11C, Setịpụ Data Mgbakwunye 21). Nyocha mmụba mkpụrụ ndụ ihe nketa gosiri mbelata a haziri ahazi na protein mitochondrial (Foto 6H–I, Setịpụ Data Mgbakwunye 22). N'ụzọ dị ịtụnanya, n'agbanyeghị oke dị iche iche nke ụdị eriri na myopathies nke ACTA1 na TNNT1 nemaline, mbelata a dabere kpamkpam na ụdị eriri nke dabere na MYH (Foto 6H na Foto Mgbakwunye 11D–I, Setịpụ Data Mgbakwunye 23). E chịkwara protein microbial atọ na myopathies nke ACTA1 ma ọ bụ TNNT1 nemaline. Abụọ n'ime obere protein ndị a, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (a makwaara dịka LINC00598 ma ọ bụ Lnc-FOXO1) na ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), gosiri na ọnụọgụ dị iche na myofibers ụdị 1. Akọpụtala na mbụ na ENSG00000215483_TR14_ORF67 na-arụ ọrụ na nhazi okirikiri sel. 56 N'aka nke ọzọ, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (dakọtara na LINC01798) mụbara na myofibers ụdị 1 na ụdị 2A na myofibers ACTA1-nemaline myopathy ma e jiri ya tụnyere njikwa ahụike (Foto mgbakwunye 12A, Setịpụ Data Mgbakwunye 24). N'ụzọ dị iche, protein ribosomal enweghị mmetụta nke nemaline myopathy, ọ bụ ezie na RPS17 belatara na ACTA1 nemaline myopathy (Foto 6E).
Nnyocha mmụba ahụ gosikwara mmụba nke usoro sistemu ahụ ji alụso ọrịa ọgụ na ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathies, ebe njikọta sel mụbara na TNNT1 nemaline myopathy (Foto 6H). Mmeju nke ihe ndị a sitere na extracellular proteins na-agbanwe PCA na PC1 na PC2 n'ụzọ na-adịghị mma (ya bụ, gaa na eriri ndị kacha emetụta) (Foto 6J). Ndị ọrịa abụọ ahụ gosipụtara mmụba nke protein extracellular ndị metụtara na nzaghachi mgbochi ọrịa na usoro ndozi sarcolemmal, dị ka annexins (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 na protein mmekọrịta ha S100A1159 (Foto mgbakwunye 12B–C). Akọpụtala na usoro a na-eme ka ọ dịkwuo mma na muscular dystrophies60 mana, dịka anyị maara, ejikọtabeghị ya na nemaline myopathies mbụ. Ọrụ nkịtị nke igwe molekul a dị mkpa maka ndozi sarcolemmal mgbe mmerụ ahụ gasịrị yana maka njikọta nke myocytes ọhụrụ e guzobere na myofibers58,61. Ya mere, mmụba nke ọrụ a na otu ndị ọrịa abụọ ahụ na-egosi mmeghachi omume nkwụghachi maka mmerụ ahụ nke enweghị ntụkwasị obi nke myofiber kpatara.
Mmetụta nke nemaline myopathy ọ bụla nwere njikọ nke ọma (r = 0.736) ma gosipụta njikọ ezi uche dị na ya (Mgbakwunye Figures 11A–B), na-egosi na ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathy nwere mmetụta yiri nke ahụ na proteome. Agbanyeghị, e nyere ụfọdụ protein naanị na ACTA1 ma ọ bụ TNNT1 nemaline myopathy (Mgbakwunye Figures 11A na C). Protein profibrotic MFAP4 bụ otu n'ime protein kachasị elu na TNNT1 nemaline myopathy mana ọ ka nọghị na ACTA1 nemaline myopathy. SKIC8, akụkụ nke PAF1C complex nke na-ahụ maka ịhazi ntụgharị mkpụrụ ndụ ihe nketa HOX, belatara na TNNT1 nemaline myopathy mana ọ metụtaghị na ACTA1 nemaline myopathy (Mgbakwunye Figure 11A). Ntụnyere kpọmkwem nke ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathy gosiri mbelata dị ukwuu na protein mitochondrial na mmụba na protein sistemu ji alụso ọrịa ọgụ na TNNT1 nemaline myopathy (Foto 6G–H na Foto Mgbakwunye 11C na 11H–I). Data ndị a kwekọrọ na nnukwu atrophy/dystrophy a hụrụ na TNNT1 nemaline myopathy ma e jiri ya tụnyere TNNT1 nemaline myopathy (Foto 6A), na-egosi na TNNT1 nemaline myopathy na-anọchite anya ụdị ọrịa ahụ ka njọ.
Iji chọpụta ma mmetụta a hụrụ nke nemaline myopathy ka dịgidere n'ọkwa akwara dum, anyị mere nnukwu nyocha proteomic nke biopsies akwara sitere n'otu ìgwè ndị ọrịa TNNT1 nemaline myopathy ma tụnyere ha na njikwa (n=3 kwa otu) (Foto Mgbakwunye 13A, Setịpụ Data Mgbakwunye 25). Dịka a tụrụ anya ya, njikwa nwere njikọ chiri anya na nyocha akụkụ bụ isi, ebe ndị ọrịa TNNT1 nemaline myopathy gosipụtara mgbanwe dị elu n'etiti sample yiri nke a hụrụ na nyocha eriri otu (Foto Mgbakwunye 13B). Nnyocha buru ibu megharịrị protein ndị a na-egosipụta dị iche iche (Foto Mgbakwunye 13C, Setịpụ Data Mgbakwunye 26) na usoro bayoloji (Foto Mgbakwunye 13D, Setịpụ Data Mgbakwunye 27) nke a gosipụtara site na ịtụnyere eriri nke ọ bụla, mana anyị furu efu ikike ịmata ọdịiche dị n'etiti ụdị eriri dị iche iche ma ghara ịkọwa maka mmetụta ọrịa dị iche iche n'ofe eriri.
N'ịchịkọta data ndị a, data ndị a na-egosi na proteomics otu-myofiber nwere ike ịkọwa njirimara ihe ndị dị ndụ nke a na-apụghị ịchọpụta site na usoro ndị a kapịrị ọnụ dịka immunoblotting. Ọzọkwa, data ndị a na-egosipụta oke nke iji actin fiber typing (MYH) naanị iji kọwaa mgbanwe phenotypic. N'ezie, ọ bụ ezie na mgbanwe ụdị eriri dị iche n'etiti actin na troponin nemaline myopathies, ma nemaline myopathies na-agbakọta ụdị eriri MYH site na metabolism eriri akwara skeletal gaa na protein akwara oxidative ngwa ngwa na nke na-adịghị oke oxidative.
Ọdịiche dị n'etiti sel dị oke mkpa maka anụ ahụ iji mezuo ihe dị iche iche ha chọrọ. Na akwara ọkpụkpụ, a na-akọwakarị nke a dị ka ụdị eriri nke a na-eji ọkwa dị iche iche nke mmepụta ike na ike ọgwụgwụ eme. Agbanyeghị, o doro anya na nke a na-akọwa naanị obere akụkụ nke mgbanwe eriri akwara ọkpụkpụ, nke dị nnọọ iche, dị mgbagwoju anya ma dị ọtụtụ karịa ka e chere na mbụ. Ọganihu teknụzụ emeela ka ìhè pụta ìhè ugbu a na ihe ndị na-achịkwa eriri akwara ọkpụkpụ. N'ezie, data anyị na-egosi na eriri ụdị 2X nwere ike ọ gaghị abụ ụdị eriri akwara ọkpụkpụ dị iche. Ọzọkwa, anyị chọpụtara protein metabolic, protein ribosomal na protein ndị metụtara sel dị ka ihe ndị bụ isi na-ekpebi ọdịiche dị n'etiti eriri akwara ọkpụkpụ. Site n'itinye usoro ọrụ proteomic anyị na ihe nlele ndị ọrịa nwere nematode myopathy, anyị gosikwara na ụdị eriri dabere na MYH anaghị egosipụta nke ọma ọdịiche dị n'etiti akwara ọkpụkpụ, karịsịa mgbe sistemụ ahụ na-agbanwe agbanwe. N'ezie, n'agbanyeghị ụdị eriri dabere na MYH, nematode myopathy na-ebute mgbanwe gaa na ngwa ngwa na obere eriri oxidative.
E kewapụrụ eriri akwara ọkpụkpụ kemgbe narị afọ nke 19. Nnyocha omics ọhụrụ enyerela anyị aka ịmalite ịghọta profaịlụ ngosipụta nke ụdị eriri MYH dị iche iche na nzaghachi ha na mkpali dị iche iche. Dịka akọwara ebe a, ụzọ omics nwekwara uru nke mmetụta dị ukwuu maka ịtụle akara ụdị eriri karịa usoro dabere na antibody ọdịnala, na-adabereghị na nha nke otu (ma ọ bụ ole na ole) akara iji kọwaa ụdị eriri akwara ọkpụkpụ. Anyị jiri usoro ọrụ transcriptomic na proteomic ma jikọta nsonaazụ iji nyochaa nhazi ederede na post-transcriptional nke eriri eriri dị na eriri akwara ọkpụkpụ mmadụ. Usoro ọrụ a mere ka a ghara ịchọpụta eriri ụdị 2X dị ọcha na ọkwa protein na vastus lateralis nke otu ụmụ okorobịa anyị nwere ahụike. Nke a kwekọrọ na ọmụmụ eriri otu gara aga nke chọpụtara <1% eriri 2X dị ọcha na vastus lateralis dị mma, ọ bụ ezie na a ga-akwado nke a na akwara ndị ọzọ n'ọdịnihu. Ihe dị iche n'etiti nchọpụta nke eriri 2X fọrọ nke nta ka ọ bụrụ ọcha na ọkwa mRNA na naanị eriri 2A/2X agwakọtara na ọkwa protein na-agbagwoju anya. Mbara MRNA isoform nke MYH abụghị nke gburugburu,67 na-egosi na o yighị ka anyị ga-enwe "ihere" mgbaàmà mmalite MYH2 n'ime eriri 2X dị ọcha na ọkwa RNA. Otu nkọwa enwere ike, ọ bụ ezie na ọ bụ naanị echiche efu, nwere ike ịbụ ọdịiche dị na protein na/ma ọ bụ mRNA kwụsiri ike n'etiti isoforms MYH. N'ezie, ọ dịghị eriri ngwa ngwa dị ọcha 100% maka isoform MYH ọ bụla, ọ dịghịkwa ama ma ọkwa ngosipụta mRNA MH1 na oke 70-90% ga-eme ka ọnụọgụ MYH1 na MYH2 hà nhata na ọkwa protein. Agbanyeghị, mgbe a na-atụle transcriptome ma ọ bụ proteome dum, nyocha ụyọkọ nwere ike ịchọpụta naanị otu ìgwè abụọ dị iche iche na-anọchite anya eriri akwara ọkpụkpụ dị nwayọ na ngwa ngwa, n'agbanyeghị ihe mejupụtara MYH ha kpọmkwem. Nke a kwekọrọ na nyocha site na iji ụzọ transcriptomic otu-nucleus, nke na-achọpụta naanị otu ìgwè myonuclear abụọ dị iche. 68, 69, 70 Ọzọkwa, ọ bụ ezie na nnyocha proteomic gara aga achọpụtala eriri ụdị 2X, eriri ndị a anaghị agbakọta iche na eriri ngwa ngwa ndị ọzọ ma na-egosi naanị obere ọnụọgụ protein dị iche iche ma e jiri ya tụnyere ụdị eriri ndị ọzọ dabere na MYH. 14 Nsonaazụ ndị a na-atụ aro na anyị kwesịrị ịlaghachi na echiche mmalite narị afọ nke 20 banyere nhazi eriri akwara, nke kewara eriri akwara ọkpụkpụ mmadụ ọ bụghị n'ime klas atọ dị iche iche dabere na MYH, kama n'ime ụyọkọ abụọ dabere na ihe ndị metụtara metabolic na contractile ha. 63
Ihe kacha mkpa bụ na a ga-atụle myofiber heterogeneity n'ọtụtụ akụkụ. Ọmụmụ ihe "omics" gara aga egosila n'ụzọ a, na-atụ aro na eriri akwara ọkpụkpụ anaghị emepụta otu ìgwè dị iche iche kama a na-ahazi ha n'usoro continuum. 11, 13, 14, 64, 71 N'ebe a, anyị na-egosi na, na mgbakwunye na ọdịiche dị na ihe ndị metụtara nkwekọrịta na metabolic nke akwara ọkpụkpụ, enwere ike ịmata ọdịiche dị n'etiti myofibers site na njirimara metụtara mmekọrịta sel na sel na usoro ntụgharị. N'ezie, anyị hụrụ ụdị ribosome heterogeneity na eriri akwara ọkpụkpụ nke na-enye aka na ụdị dị iche iche na-adabereghị na ụdị eriri nwayọ na ngwa ngwa. Isi ihe kpatara nnukwu myofiber heterogeneity a, n'adabereghị na ụdị eriri nwayọ na ngwa ngwa, ka edoghị anya, mana ọ nwere ike igosi nhazi oghere pụrụ iche n'ime akwara fascicles nke na-aza ike na ibu ụfọdụ nke ọma, 72 nkwukọrịta cellular ma ọ bụ akụkụ ahụ pụrụ iche na ụdị sel ndị ọzọ na gburugburu akwara 73,74,75 ma ọ bụ ọdịiche dị na ọrụ ribosome n'ime myofibers nke ọ bụla. N'ezie, a hụla na ribosomal heteroplasmy, ma site na mgbanwe paralogous nke RPL3 na RPL3L ma ọ bụ na ọkwa nke 2′O-methylation nke rRNA, jikọtara ya na hypertrophy akwara ọkpụkpụ76,77. Ngwa multi-omic na oghere jikọtara ya na njirimara ọrụ nke myofibers nke ọ bụla ga-eme ka nghọta anyị banyere bayoloji akwara dịkwuo elu na ọkwa multi-omic78.
Site n'inyocha proteomes nke otu myofibers sitere n'aka ndị ọrịa nwere nemaline myopathies, anyị gosikwara uru, irè, na ojiji nke otu myofiber proteomics iji kọwaa pathophysiology ahụike nke akwara ọkpụkpụ. Ọzọkwa, site n'ịtụnyere usoro ọrụ anyị na nyocha proteomic zuru ụwa ọnụ, anyị nwere ike igosi na otu myofiber proteomics na-enye otu omimi nke ozi dị ka proteomics anụ ahụ zuru ụwa ọnụ ma na-agbatị omimi a site na ịkọwa ụdị interfiber na ụdị myofiber. Na mgbakwunye na ọdịiche a tụrụ anya ya (ọ bụ ezie na ọ dị iche) na oke ụdị eriri a hụrụ na ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathies ma e jiri ya tụnyere njikwa ahụike,19 anyị hụkwara mgbanwe oxidative na extracellular na-adabereghị na mgbanwe ụdị eriri MYH. A kọọla Fibrosis na TNNT1 nemaline myopathies.19 Agbanyeghị, nyocha anyị na-ewulite na nchọpụta a site n'igosi mmụba nke protein ndị metụtara nrụgide sitere na mpụga, dị ka annexins, ndị metụtara usoro ndozi sarcolemmal, na myofibers sitere na ndị ọrịa nwere ACTA1 na TNNT1 nemaline myopathies.57,58,59 Na mmechi, mmụba nke ọkwa annexin na myofibers sitere na ndị ọrịa nwere nemaline myopathy nwere ike ịnọchite anya nzaghachi sel maka ndozi nke nnukwu myofibers atrophic.
Ọ bụ ezie na ọmụmụ ihe a na-anọchite anya nyocha kachasị ukwuu nke otu eriri dum-muscle-omics nke ụmụ mmadụ ruo taa, ọ bụghị na-enweghị oke. Anyị kewapụrụ eriri akwara ọkpụkpụ site na obere na otu ihe atụ nke ndị sonyere na otu akwara (vastus lateralis). Ya mere, ọ gaghị ekwe omume iwepụ ọnụnọ nke eriri kpọmkwem n'ofe ụdị akwara na oke nke physiology akwara. Dịka ọmụmaatụ, anyị enweghị ike iwepụ ohere nke obere eriri ultrafast (dịka ọmụmaatụ, eriri 2X dị ọcha) na-apụta na ndị na-agba ọsọ a zụrụ nke ọma na/ma ọ bụ ndị egwuregwu ike79 ma ọ bụ n'oge enweghị mmega ahụ muscle66,80. Ọzọkwa, obere nha nke ndị sonyere gbochiri anyị inyocha ọdịiche mmekọahụ na eriri dị iche iche, ebe a maara na oke ụdị eriri dị iche n'etiti ụmụ nwoke na ụmụ nwanyị. Ọzọkwa, anyị enweghị ike ịme nyocha transcriptomic na proteomic na otu eriri akwara ma ọ bụ ihe atụ sitere na otu ndị sonyere. Ka anyị na ndị ọzọ na-aga n'ihu na-eme ka nyocha otu mkpụrụ ndụ na otu myofiber dịkwuo mma site na iji nyocha omics iji nweta ntinye ihe nlele dị oke ala (dịka egosiri ebe a na nyocha nke eriri sitere n'aka ndị ọrịa nwere mytochondria myopathy), ohere ijikọta ụzọ multi-omics (na ọrụ) n'ime eriri akwara otu pụtara ìhè.
N'ozuzu, data anyị na-achọpụta ma na-akọwa ihe ndị na-akpata mgbanwe na mgbanwe na akwara ọkpụkpụ. Karịsịa, anyị na-egosi data ndị na-ama aka na nkwenkwe ogologo oge na physiology nke akwara ọkpụkpụ metụtara nkọwa nke ụdị eriri nke MYH nke oge ochie. Anyị na-atụ anya imegharị arụmụka ahụ ma mechaa tụgharịa uche n'echiche anyị banyere nhazi eriri akwara ọkpụkpụ na ọdịiche dị n'etiti ha.
Ndị sonyere na Caucasian iri na anọ (ụmụ nwoke iri na abụọ na ụmụ nwanyị abụọ) kwetara isonye na nnyocha a. Kọmitii Omume nke Ụlọ Ọgwụ Mahadum Ghent (BC-10237) kwadoro ọmụmụ ihe a, ha rubeere isi na Nkwupụta Helsinki nke 2013, e denyekwara ha aha na ClinicalTrials.gov (NCT05131555). E gosipụtara njirimara izugbe nke ndị sonyere na Tebụl Mgbakwunye 1. Mgbe ha nwetasịrị nkwenye okwu ọnụ na ederede, ndị sonyere mere nyocha ahụike tupu e tinye ha na ọmụmụ ihe ahụ. Ndị sonyere dị obere (afọ 22–42), ahụike ha (enweghị ọnọdụ ahụike ha, enweghị akụkọ ihe mere eme nke ise siga), na ndị na-arụsi ọrụ ike nke ọma. E ji usoro ergometer chọpụta oke ikuku oxygen e tinyere iji nyochaa ahụike ahụ dịka akọwara na mbụ. 81
A chịkọtara ihe nlele biopsy akwara n'oge ezumike na n'ọnọdụ ibu ọnụ ugboro atọ, ụbọchị iri na anọ dị iche. Ebe ọ bụ na a chịkọtara ihe nlele ndị a dịka akụkụ nke ọmụmụ ihe buru ibu, ndị sonyere riri placebo (lactose), onye na-emegide H1-receptor antagonist (540 mg fexofenadine), ma ọ bụ onye na-emegide H2-receptor antagonist (40 mg famotidine) nkeji iri anọ tupu biopsy ahụ. Anyị egosila na mbụ na ndị na-emegide histamine receptor antagonists ndị a anaghị emetụta ahụ ike akwara skeletal skeletal81, a hụghịkwa nchịkọta steeti ọ bụla na atụmatụ njikwa mma anyị (Ihe Ndị Ọzọ 3 na 6). A na-eri nri ọkọlọtọ (41.4 kcal/kg ibu ahụ, 5.1 g/kg carbohydrate dị arọ, 1.4 g/kg protein dị arọ ahụ, na 1.6 g/kg abụba dị arọ ahụ) ruo awa iri anọ na asatọ tupu ụbọchị nnwale ọ bụla, a na-erikwa nri ụtụtụ ọkọlọtọ (1.5 g/kg carbohydrate dị arọ ahụ) n'ụtụtụ nke ụbọchị nnwale ahụ. N'okpuru ọgwụ mgbu mpaghara (0.5 ml 1% lidocaine na-enweghị epinephrine), e si n'akwara vastus lateralis nweta biopsies site na iji percutaneous Bergström aspiration.82 E tinyere ihe nlele akwara ozugbo na RNA ma e mesịa ma debe ya na okpomọkụ 4°C ruo mgbe eriri aka ga-apụ apụ (ruo ụbọchị atọ).
E bufere ngwugwu myofiber e kewapụrụ ọhụrụ na ihe dị ọhụrụ RNAlater n'ime efere omenala. E jiri stereomicroscope na obere tweezers wepụ myofibers nke ọ bụla n'aka. E kewara eriri iri abụọ na ise site na biopsy ọ bụla, na-elebara anya nke ọma n'ịhọrọ eriri sitere na mpaghara dị iche iche nke biopsy ahụ. Mgbe e kewara ya, e tinyere eriri ọ bụla nwayọ n'ime 3 μl nke lysis buffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) nke nwere proteinase K na DNase enzymes iji wepụ protein na DNA achọghị. E wee malite lysis cell na mwepụ protein/DNA site na obere vortex, na-atụgharị mmiri mmiri ahụ na microcentrifuge, ma na-etinye ya na okpomọkụ ụlọ (nkeji 10). E mesịa tinye lysate ahụ na thermal cycler (T100, Bio-Rad) na 37°C maka nkeji 5, 75°C maka nkeji 5, wee chekwaa ya ozugbo na -80°C ruo mgbe a ga-ahazi ya ọzọ.
E ji 2 µl nke myofiber lysate nke QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) kwadebe ọbá akwụkwọ RNA nke dakọtara na Illumina. Enwere ike ịchọta ụzọ zuru ezu n'akwụkwọ ntuziaka nke onye nrụpụta. Usoro a na-amalite site na njikọta cDNA nke mbụ site na ntụgharị azụ, n'oge a na-ewebata ihe njirimara molekul pụrụ iche (UMIs) na barcode i1 kpọmkwem iji hụ na a na-ejikọta ihe nlele ma belata mgbanwe teknụzụ n'oge nhazi ala. A na-ejikọta cDNA site na myofibers 96 ma jiri beads magnet mee ka ọ dị ọcha, mgbe nke ahụ gasịrị, a na-ewepụ RNA ma jiri praịma na-enweghị usoro mee njikọta nke abụọ. A na-eji beads magnet mee ka ọbá akwụkwọ ahụ dị ọcha, a na-agbakwụnye mkpado i5/i7 kpọmkwem maka ọdọ mmiri, ma mee ka PCR dịkwuo elu. Nzọụkwụ nhicha ikpeazụ na-emepụta ọbá akwụkwọ dakọtara na Illumina. E jiri ngwa nyocha DNA nke nwere mmetụta dị elu (Agilent Technologies, DNF-477-0500) nyochaa ịdị mma nke ọbá akwụkwọ ọ bụla.
Dabere na nha Qubit, a chịkọtara ọdọ mmiri ndị ọzọ na njupụta equimolar (2 nM). E mesịa jiri ngwa NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nucleotides) mee usoro nke ihe dị ka nM abụọ (4% PhiX).
Ọdụ anyị dabere na usoro nyocha data nke Lexogen's QuantSeq Pool (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). E buru ụzọ wepụ data site na iji bcl2fastq2 (v2.20.0) dabere na usoro i7/i5. E jiri idemux (v0.1.6) wepụ Read 2 dabere na usoro barcode i1 ma wepụta usoro UMI site na iji umi_tools (v1.0.1). E jiri cutadapt (v3.4) belata agụmagụ n'ọtụtụ agba iji wepụ obere agụmagụ (<20 n'ogologo) ma ọ bụ agụmagụ nke nwere naanị usoro ihe nkwụnye. E jiri STAR (v2.6.0c) hazie agụmagụ na genome mmadụ ma jiri SAMtools (v1.11) wepụ faịlụ BAM. E jiri umi_tools (v1.0.1) wepụ agụmagụ abụọ. N'ikpeazụ, e mere ọnụọgụgụ nhazi site na iji featureCounts na Subread (v2.0.3). E jiri FastQC (v0.11.9) mee njikwa mma n'ọtụtụ ọkwa dị n'etiti nke ọkpọkọ ahụ.
E mere nhazi na ịhụ ihe niile gbasara bioinformatics na R (v4.2.3), nke kachasị site na iji usoro ọrụ Seurat (v4.4.0). 83 Ya mere, agbanwere ụkpụrụ UMI na matrices metadata ka ọ bụrụ ihe Seurat. E wepụrụ mkpụrụ ndụ ihe nketa ndị a na-egosi na ihe na-erughị 30% nke eriri niile. E wepụrụ ihe nlele ndị na-adịghị mma dabere na oke kacha nta nke uru UMI 1000 na mkpụrụ ndụ ihe nketa 1000 achọpụtara. N'ikpeazụ, eriri 925 gafere usoro nzacha njikwa mma niile. Ejiri usoro Seurat SCTransform v2 mee ka ụkpụrụ UMI dị mma, 84 gụnyere atụmatụ 7418 niile achọpụtara, na e wepụrụ ọdịiche dị n'etiti ndị sonyere. Enwere ike ịchọta metadata niile dị mkpa na Dataset Mgbakwunye 28.